ข่าว - การผลิตและการศึกษาลักษณะทางชีวเคมีของเอนไซม์แลคเคสจากเห็ดนางรม NRC 620 และการประเมินประสิทธิภาพในการทำให้ใสของน้ำแอปเปิล

หลังจากบ่มนิ่งแบบคงที่ที่อุณหภูมิ 28°C เป็นเวลา 25 วัน เอนไซม์แลคเคสจาก *Pleurotus ostreatus* NRC620 แสดงกิจกรรมสูงสุดในอาหารเลี้ยงเชื้อรา ค่า pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดสำหรับเอนไซม์นี้คือ 3.0 และ 70°C ตามลำดับ หลังจากบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 40°C และ 50°C กิจกรรมของเอนไซม์ยังคงอยู่ที่ 68.33% และ 59.61% ตามลำดับ หลังจากบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงในบัฟเฟอร์ซิเตรต-ฟอสเฟต (pH 7.0) กิจกรรมของเอนไซม์ยังคงอยู่ที่ 100% การเติม MgSO₄ และ CuSO₄ ความเข้มข้น 10 mM เพิ่มกิจกรรมของเอนไซม์ประมาณ 21% และ 35% ตามลำดับ ในขณะที่ NaCl, MnCl₂, KCl และ CaCl₂ ยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์ เมื่อใช้ ABTS เป็นสารตั้งต้น พารามิเตอร์จลนศาสตร์ (Km และ Vmax) ของเอนไซม์แลคเคสจาก *Pleurotus ostreatus* NRC 620 คือ 1.99 mM และ 16,217 μmol min−1 L−1 ตามลำดับ การบำบัดตัวอย่างน้ำแอปเปิลด้วยเอนไซม์ช่วยลดทั้งค่า pH และความหนืดลงอย่างมีนัยสำคัญ และการลดลงนี้มีความสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นของระยะเวลาการเก็บรักษา การบำบัดด้วยแลคเคสส่งผลให้ปริมาณฟีนอลทั้งหมดในน้ำแอปเปิลลดลงเล็กน้อย แต่ไม่พบการลดลงของกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ
ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา นักวิจัยได้ให้ความสำคัญกับการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีชีวภาพสีเขียวในอุตสาหกรรมอาหาร เอนไซม์แลคเคสเป็นหนึ่งในเอนไซม์ที่มีประโยชน์มากที่สุดในอุตสาหกรรมอาหาร โดยมีการนำไปประยุกต์ใช้ในด้านต่างๆ เช่น การแปรรูปน้ำผลไม้ การอบขนม การรักษาเสถียรภาพของไวน์ และการปรับปรุงคุณภาพด้านประสาทสัมผัสของผลิตภัณฑ์อาหาร^¹พืชชั้นสูงและจุลินทรีย์หลายชนิดหลั่งเอนไซม์แลคเคสออกมา^²และเชื้อรา เช่น ดิวเทอโรไมซีส แอสโคไมซีส และเบซิดิโอไมซีส ก็สามารถผลิตเอนไซม์แลคเคสได้เช่นกัน^³แลคเคส (EC 1.10.3.2) เป็นเอนไซม์ออกซิเดสสีน้ำเงินที่ลดโมเลกุลออกซิเจนให้กลายเป็นน้ำโดยใช้ระบบที่ประกอบด้วยอะตอมทองแดงสามชนิดที่แตกต่างกัน จึงสามารถออกซิไดซ์สารประกอบฟีนอลและอะโรมาติกเอมีนต่างๆ ได้ ในระหว่างการผลิตน้ำผลไม้และน้ำผัก การเกิดสีน้ำตาลจากเอนไซม์และไม่ใช้เอนไซม์เป็นปัญหาสำคัญ^⁴เนื่องจากสารเหล่านี้ส่งผลเสียต่อสี รสชาติ และกลิ่นของน้ำผลไม้ จึงจำเป็นต้องกำจัดออกไป^⁵
ในบรรดาผลไม้ทั้งหมด แอปเปิลเป็นผลไม้ที่บริโภคมากที่สุดทั่วโลกและในสหภาพยุโรป ในปี 2019 การผลิตแอปเปิลอยู่ในอันดับที่สามของโลก โดยมีปริมาณมากกว่า 87 ล้านตัน^⁶แอปเปิลมีสารประกอบฟีนอลหลายชนิด รวมถึงฟลาโวนอยด์และกรดฟีนอล เช่น กรดคาเฟอิกและกรดคลอโรเจนิค^⁷เนื่องจากน้ำแอปเปิลมักถูกบริโภคในรูปแบบใส ทำให้สารประกอบฟีนอลประมาณ 50% ถึง 90% สูญเสียไปในระหว่างกระบวนการกรอง^⁸ปัจจุบัน ผู้บริโภคมักเลือกผลิตภัณฑ์ที่ผ่านกระบวนการแปรรูปน้อยที่สุด เช่น น้ำแอปเปิลขุ่นที่มีปริมาณโพลีฟีนอลสูง อย่างไรก็ตาม เนื่องจากมีปริมาณฟีนอลสูง น้ำแอปเปิลประเภทนี้จึงไวต่อการเปลี่ยนสีและคล้ำลงเป็นพิเศษ^⁹มีการนำเทคโนโลยีต่างๆ มาใช้ รวมถึงวิธีการให้ความร้อน เช่น การพาสเจอร์ไรส์ที่อุณหภูมิ 60–90 องศาเซลเซียส เพื่อลดหรือป้องกันการเปลี่ยนสีของน้ำแอปเปิล^¹⁰อย่างไรก็ตาม จากการวิจัยของ Sauceda-Gálvez^¹¹การแปรรูปด้วยความร้อนอาจทำลายสารเคมีระเหยและส่งผลกระทบต่อคุณสมบัติทางประสาทสัมผัสของน้ำแอปเปิล ทางเลือกอื่นนอกเหนือจากวิธีการแปรรูปด้วยความร้อน ได้แก่ คาร์บอนไดออกไซด์ยิ่งยวด รังสีอัลตราไวโอเลต อัลตราซาวนด์ ความดันไฮโดรสแตติกสูง หรือการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยความดันสูง¹²ประสิทธิภาพของเทคโนโลยีเหล่านี้และปริมาณน้ำผลไม้ที่ได้ขึ้นอยู่กับพารามิเตอร์ที่ใช้และลักษณะของผลิตภัณฑ์ การใช้งานอย่างแพร่หลายถูกจำกัดด้วยต้นทุนที่สูง ผลกระทบด้านลบต่อคุณภาพของผลิตภัณฑ์อาหารบางชนิด หรือการยับยั้งเอนไซม์ที่ไม่เพียงพอ^{^13,14}
เอนไซม์แลคเคสสามารถใช้ในการทำให้ผลไม้มีความคงตัวและใสขึ้นได้^¹⁵โกกเมนและคณะ^¹⁶ขอแนะนำให้ใช้เอนไซม์แลคเคสในการทำให้ใสของน้ำผลไม้ เนื่องจากสามารถกำจัดสารประกอบฟีนอลได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยการเปลี่ยนสารประกอบเหล่านั้นให้เป็นพอลิเมอร์หรือโอลิโกเมอร์ ซึ่งสามารถกำจัดออกได้ง่ายด้วยเยื่อกรองแบบอัลตราฟิลเทรชัน ทำให้่น้ำแอปเปิลคงสีและความใสได้นานถึงหกสัปดาห์ที่อุณหภูมิ 50°C เอนไซม์แลคเคสจากเชื้อรา *Trichoderma* ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์แล้วถูกตรึงไว้บนเม็ดอะลูมินาและนำมาใช้ในการกำจัดสารประกอบที่ทำให้เกิดกลิ่นไม่พึงประสงค์ซึ่งเกิดจากการปนเปื้อนของจุลินทรีย์ในน้ำแอปเปิลอย่างเลือกสรร^¹⁷
สารประกอบระเหยง่ายในน้ำแอปเปิลประมาณ 80-90% คือเอสเทอร์และอัลดีไฮด์ ซึ่งเป็นสารที่ให้กลิ่นหอมเฉพาะตัวแก่น้ำแอปเปิล^¹⁸เอนไซม์แลคเคสจาก *Trametes versicolor* ถูกตรึงไว้บนวัสดุรองรับราคาประหยัดที่ทำจากเส้นใยธรรมชาติจากเปลือกมะพร้าวอ่อน เพื่อใช้ในการทำให้่น้ำแอปเปิลใสขึ้น^¹⁹งานวิจัยก่อนหน้านี้ได้ศึกษาการรักษาเสถียรภาพของน้ำแอปเปิล (สีและความขุ่น) โดยใช้วิธีการที่ไม่ใช้เอนไซม์หรือวิธีการตรึงเอนไซม์ หรือใช้ร่วมกับการกรองแบบอัลตราฟิลเทรชัน^{^5,19}อย่างไรก็ตาม ผลกระทบของเอนไซม์แลคเคสจากเชื้อราต่อคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของน้ำแอปเปิลระหว่างการเก็บรักษายังไม่ชัดเจน ดังนั้น จุดประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของคุณสมบัติทางกายภาพและเคมี ปริมาณสารประกอบฟีนอล และฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของน้ำแอปเปิลหลังจากได้รับการบำบัดด้วยเอนไซม์แลคเคสจากเชื้อราและเก็บรักษาในตู้เย็นเป็นเวลาสองสัปดาห์ เอนไซม์แลคเคสมีความสามารถในการออกซิไดซ์สารประกอบฟีนอล ซึ่งทำให้มีศักยภาพในการนำไปใช้ในกระบวนการทางอุตสาหกรรมต่างๆ รวมถึงการทำให้ใสของน้ำผลไม้ การศึกษาครั้งนี้ได้ตรวจสอบเอนไซม์แลคเคสจากเห็ดนางฟ้า *Pleurotus ostreatus* NRC 620 โดยมุ่งเน้นที่สภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับกิจกรรมและประสิทธิภาพในการทำให้ใสของน้ำผลไม้ แม้ว่าการวิจัยเกี่ยวกับเห็ดนางฟ้า (P. ostreatus NRC 620) ยังมีจำกัด แต่การศึกษาในอดีตได้ตรวจสอบเอนไซม์จากแหล่งเชื้อราต่างๆ เช่น Trametes versicolor และ Ganoderma lucidum จุดประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อประเมินศักยภาพในการนำเอนไซม์นี้ไปประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมอาหาร และเน้นคุณสมบัติเฉพาะตัว โดยเฉพาะอย่างยิ่งค่า pH และอุณหภูมิที่เหมาะสม
2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) ซื้อจาก Sigma-Aldrich (แคนาดา) สารเคมีอื่นๆ ทั้งหมดเป็นเกรดวิเคราะห์
ศูนย์รวบรวมจุลินทรีย์ของศูนย์วิจัยแห่งชาติได้รับสายพันธุ์เห็ดนางฟ้า NRC620 ที่ทราบแล้ว หลังจากเพาะเลี้ยงต่อแล้ว สายพันธุ์นี้ถูกเก็บรักษาไว้บนอาหารเลี้ยงเชื้อมันฝรั่งเดกซ์โทรสแบบเอียงที่อุณหภูมิ 4°C วิธีการเตรียมเชื้อเริ่มต้นมีดังนี้: เส้นใยเห็ดอายุ 10 วันที่เจริญเติบโตเต็มที่แล้วถูกนำไปเพาะลงบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อมันฝรั่งเดกซ์โทรสและบ่มที่อุณหภูมิ 28°C หลังจาก 10 วัน เส้นใยเห็ดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 12 มม. จำนวน 3 ก้อนถูกนำออกจากอาหารเลี้ยงเชื้อโดยใช้ที่เจาะโลหะปลอดเชื้อและวางลงในขวดรูปทรงกรวยขนาด 250 มล. ที่อุดด้วยสำลีซึ่งบรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว 50 มล. (pH 5.0 ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Othman และคณะ)²⁰นำเชื้อไปบ่มที่อุณหภูมิ 28°C เป็นเวลา 18 วัน จากนั้นกรองเชื้อผ่านกระดาษกรอง Whatman เบอร์ 1 และใช้สารละลายส่วนบนเป็นแหล่งเอนไซม์
วัดกิจกรรมของเอนไซม์แลคเคสโดยใช้ ABTS เป็นสารตั้งต้น สารละลายปฏิกิริยา (2 มล.) ประกอบด้วย ABTS 0.3 mM จำนวน 500 μL (ละลายในบัฟเฟอร์โซเดียมซิเตรต 0.1 M, pH 4.5) และตัวอย่างเอนไซม์ในปริมาณที่ต้องการเจือจางด้วยน้ำกลั่น^{^21,22}เนื่องจากแลคเคสสามารถออกซิไดซ์ ABTS ได้ที่อุณหภูมิห้อง (28 °C ± 2) จึงได้ทำการวัดการออกซิเดชันของ ABTS โดยการวัดการเพิ่มขึ้นของค่าการดูดกลืนแสงที่ 420 nm (ε)₄₂₀= 36,000 ซม.^{^-1} M ^{^-1}โดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV รุ่น Agilent Carry-100 ต้องใช้เอนไซม์แลคเคส 1 หน่วยในการออกซิไดซ์ ABTS 1 ไมโครโมลต่อนาที ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยวิธีแบรดฟอร์ด โดยใช้แอลบูมินจากซีรั่มวัวเป็นตัวควบคุมภายใน^{^23,24}
หลังจากสกัดเอนไซม์จากเห็ดนางฟ้าสายพันธุ์ NRC 620 แล้ว ได้ทำการวัดกิจกรรมของเอนไซม์ในช่วงเวลาการเพาะเลี้ยงที่แตกต่างกันเป็นเวลา 25 วัน ภายใต้สภาวะคงที่ที่อุณหภูมิ 28 °C
เพื่อศึกษาผลของอุณหภูมิต่อกิจกรรมของเอนไซม์แลคเคส จึงได้ทำการทดลองในช่วงอุณหภูมิ 20 ถึง 90 องศาเซลเซียส ก่อนเติมเอนไซม์และเริ่มปฏิกิริยา ได้ทำการผสมบัฟเฟอร์ (โซเดียมซิเตรต 0.1 M, pH 4.5) และสารตั้งต้น (ABTS) แล้วบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิต่างๆ จากนั้นจึงประเมินความเสถียรทางความร้อนของเอนไซม์โดยการบ่มในบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต 0.05 M (pH 7.0) ที่อุณหภูมิ 40, 50, 60 และ 70 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ตามลำดับ แล้วจึงประเมินกิจกรรมที่เหลืออยู่โดยใช้สารตั้งต้น ABTS
ประเมินผลของค่า pH ต่อกิจกรรมของเอนไซม์แลคเคสโดยใช้ ABTS เป็นสารตั้งต้นในบัฟเฟอร์ซิเตรต-ฟอสเฟต 0.1 M ที่มีช่วง pH ตั้งแต่ 2.5 ถึง 7.0 นำสารละลายเอนไซม์ไปบ่มที่อุณหภูมิ 40°C เป็นเวลาสองชั่วโมงในบัฟเฟอร์ซิเตรตและบัฟเฟอร์ Tris 0.1 M (pH 3, 4, 6 และ 7) เพื่อประเมินความเสถียรของ pH คำนวณกิจกรรมที่เหลืออยู่โดยใช้ ABTS เป็นสารตั้งต้นหลังจากการบ่ม
นำเอนไซม์แลคเคสไปบ่มในบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต (0.05 M, pH 7.0) ที่มีไอออนโลหะต่างๆ (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ และ Mn2+) ที่ความเข้มข้น 2.5 mM และ 10 mM ตามลำดับ เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นจึงเติมสารตั้งต้น (ABTS) เพื่อเริ่มปฏิกิริยา และประเมินกิจกรรมสัมพัทธ์
วัดการออกซิเดชันของ ABTS โดยแลคเคสที่ความเข้มข้นต่างๆ (0.025–3 mM) ที่ pH 4.5 เพื่อหาค่าพารามิเตอร์จลนศาสตร์ (Vmax และ Km)^{ค่าคงที่}ค่าคงที่จลนศาสตร์ของสมการ Michaelis-Menten คำนวณโดยใช้กราฟ Lineweaver-Burk ซึ่งแสดงค่าผกผันของอัตราการเกิดปฏิกิริยาเป็นฟังก์ชันของความเข้มข้นของสารตั้งต้น ค่าคงที่จลนศาสตร์คำนวณจากกราฟ Lineweaver-Burk โดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism เวอร์ชัน 6.01
หลังจากล้างแอปเปิลด้วยน้ำประปาอย่างทั่วถึงแล้ว นำไปผ่าครึ่งและคั้นน้ำโดยใช้เครื่องคั้นน้ำแอปเปิลอัตโนมัติ Braun MP80 (ผลิตในประเทศเยอรมนี) น้ำแอปเปิลที่ได้ถูกกรองผ่านผ้าขาวบางสี่ชั้น กลุ่มควบคุมไม่ได้เติมเอนไซม์ใดๆ ในขณะที่กลุ่มทดลองเติมเอนไซม์แลคเคส 2.0% (ความเข้มข้นที่ได้ผลดีที่สุดในการทดสอบ) ลงในน้ำแอปเปิลที่คั้นสดใหม่ จากนั้นเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลาสองสัปดาห์
ปริมาณกรดที่สามารถไทเทรตได้ (TA) และค่า pH ถูกกำหนดตามวิธีการของ Boulton et al.^อัล.27ค่า pH ของแต่ละตัวอย่างถูกวัดโดยใช้เครื่องวัด pH แบบดิจิทัล (เครื่องวัด pH JENWAY 3510) ค่าความเป็นกรดที่สามารถไทเทรตได้ (TA) คำนวณจากกรดมาลิกโดยใช้สูตรต่อไปนี้
โดยที่ V และ C คือปริมาตร (มิลลิลิตร) และความเข้มข้น (0.1 โมล/ลิตร) ของสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ที่ใช้ในการไทเทรต ตามลำดับ K คือค่าสัมประสิทธิ์การแปลงกรดมาลิก เท่ากับ 0.067 และ W คือมวล (กรัม) ของน้ำแอปเปิล
ปริมาณของแข็งที่ละลายได้ทั้งหมด (^{ทีดีเอส}ปริมาณสาร (QC) ในตัวอย่างน้ำผลไม้ทั้งหมดถูกกำหนดโดยใช้เครื่องวัดดัชนีหักเหแสงแบบพกพา PAL-1 (ATAGO, โตเกียว, ญี่ปุ่น) หลังจากการวัดแต่ละครั้ง เลนส์ออปติคอลจะถูกล้างด้วยน้ำปราศจากไอออน และตัวอย่างน้ำแอปเปิลแต่ละตัวอย่างจะถูกทดสอบสามครั้ง ค่าสำหรับแต่ละตัวอย่างคำนวณโดยการหาค่าเฉลี่ยของการวัดทั้งสามครั้ง ค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสำหรับตัวอย่างน้ำแอปเปิลแต่ละตัวอย่างก็คำนวณโดยการหาค่าเฉลี่ยของผลลัพธ์เหล่านี้เช่นกัน
ความหนืดและความยืดหยุ่นของตัวอย่างน้ำแอปเปิลถูกประเมินโดยใช้เครื่องวัดความหนืดแบบหมุน (RV, Rheotest 2, เยอรมนี) โดยวางตัวอย่างไว้ในกระบอก “S2” ของเครื่องวัดความหนืด ความหนืดปรากฏแสดงโดยความชันของกราฟความเค้นเฉือนเทียบกับอัตราการเฉือน ซึ่งคำนวณจากความเค้นเฉือนและกราฟที่สอดคล้องกันที่อัตราการเฉือนต่างๆ (ตั้งแต่ 1.00 ถึง 437.4 s⁻¹) สูตรสำหรับการคำนวณความหนืดปรากฏมีดังนี้:
โดยที่ η คือความหนืดปรากฏ (cP), τ คือความเค้นเฉือน (dyn/cm²), γ คืออัตราการเฉือน (sec⁻¹) และ (τ) คำนวณโดยใช้ค่าแรงบิด (α) และค่ากระบอกสูบ (Z) โดยใช้สูตรต่อไปนี้: τ = Z . α.
ดัชนีการเกิดสีน้ำตาลถูกกำหนดตามวิธีการของ Meidav et^อัล.29นำตัวอย่างน้ำผลไม้ 10 มล. ไปปั่นเหวี่ยงที่ 2750 xg เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นนำส่วนของเหลวใส (supernatant) ของน้ำผลไม้ 5 มล. มาผสมกับเอทานอล 95% จำนวน 5 มล. แล้ววัดค่าการดูดกลืนแสงของส่วนผสมที่ความยาวคลื่น 420 นาโนเมตร โดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ยูวีของ Shimadzu (UV-1601 PC)
ปริมาณฟีนอลทั้งหมด (TPC) ถูกกำหนดโดยวิธีวัดสีโดยใช้รีเอเจนต์ Folin-Ciocalteu ตามที่อธิบายโดย Boulton et al.^[27]. มีการสร้างกราฟมาตรฐานของกรดแกลลิกสำหรับความเข้มข้นตั้งแต่ 0 ถึง 500 มก./ลิตร (^ร²= 0.997) ผลลัพธ์แสดงในรูปของเทียบเท่ากรดแกลลิก (มิลลิกรัม GAE/มิลลิลิตร)
เติมน้ำกลั่น 125 ไมโครลิตร และสารละลาย FRAP 2850 ไมโครลิตร ลงในน้ำแอปเปิล 25 ไมโครลิตร แล้วทิ้งส่วนผสมไว้ในที่มืดเป็นเวลา³⁰จากนั้นวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 593 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV ของ Shimadzu (UV-1601 PC) เตรียมรีเอเจนต์ FRAP โดยผสมบัฟเฟอร์อะซิเตต 300 มิลลิโมลาร์ (pH 3.6), เหล็ก(III) คลอไรด์ 20 มิลลิโมลาร์ และ 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazine (TPTZ) 10 มิลลิโมลาร์ (ละลายใน HCl 40 มิลลิโมลาร์) ในอัตราส่วน 10:1:1 สร้างกราฟมาตรฐานโดยใช้ Trolox เป็นสารมาตรฐาน (^{อาร์²}= 0.999) และผลลัพธ์แสดงในหน่วย μM Trolox/mL
ได้ทำการตรวจสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของน้ำผลไม้ที่ผ่านการบำบัดและไม่ผ่านการบำบัดโดยใช้วิธี DPPH เพื่อประเมินความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH^³¹นำน้ำผลไม้ 10 ไมโครลิตร ผสมกับสารละลาย DPPH (100 μM) ในเมทานอล 1 มิลลิลิตร หลังจากทำปฏิกิริยาในที่มืดเป็นเวลา 30 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงของส่วนผสมที่ความยาวคลื่น 517 นาโนเมตร โดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV ของ Shimadzu (UV-1601 PC) ผลลัพธ์แสดงในรูปของค่าเทียบเท่าโทรลอกซ์ (μM โทรลอกซ์/มิลลิลิตร) โดยอ้างอิงจากกราฟสอบเทียบ (^_R2= 0.990)
ข้อมูลที่ได้แสดงให้เห็นว่า การผลิตเอนไซม์แลคเคสสูงสุดเกิดขึ้นในเห็ดนางฟ้าสายพันธุ์ NRC 620 เมื่อสิ้นสุดวันที่ 18 ของการหมัก โดยมีกิจกรรมของเอนไซม์สูงถึง 1302 U/L ข้อมูลนี้ใช้เป็นพื้นฐานในการกำหนดระยะเวลาการเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการผลิตเอนไซม์แลคเคส (รูปที่ 1) แม้ว่าการผลิตเอนไซม์จะเพิ่มขึ้นตามระยะเวลาการเพาะเลี้ยงที่เพิ่มขึ้น แต่ก็ไม่ได้หมายความว่าอัตราการเพิ่มขึ้นจะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับระยะเวลาการเพาะเลี้ยง หลังจาก 21 วัน กิจกรรมของเอนไซม์เพิ่มขึ้นเพียง 90 U/L (เป็น 1390 U/L) ดังนั้นจึงเลือก 18 วันเป็นระยะเวลาการเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมที่สุด เพื่อให้ได้ผลผลิตที่สมดุลกับผลประโยชน์ทางเศรษฐกิจจากการเพิ่มระยะเวลาการเพาะเลี้ยง
ผลของระยะเวลาการเพาะเลี้ยงต่อปริมาณเอนไซม์แลคเคสใน Pleurotus ostreatus NRC 620 นำก้อนเส้นใยเชื้อราขนาด 12 มม. จำนวน 3 ก้อน มาเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อปลอดเชื้อ 50 มล. แล้วนำไปเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 28 °C เป็นระยะเวลาต่างๆ กัน
ผลการศึกษาของเราสอดคล้องกับการศึกษาอื่นๆ โดยบ่งชี้ว่าระยะเวลาการเพาะเลี้ยงที่เหมาะสมที่สุดเพื่อให้เชื้อราหลั่งเอนไซม์แลคเคสได้สูงสุดน่าจะอยู่ระหว่าง 7 ถึง 36 วัน^³²ตามที่ Ezike และคณะกล่าวไว้^³³*Trametes polyzona* WRF03 ผลิตเอนไซม์แลคเคสได้ในปริมาณสูงสุดเมื่อสิ้นสุดวันที่เก้าของการหมัก โดยมีกิจกรรมจำเพาะ 1637 U/mg โปรตีน นอกจากนี้ Othman et al.^³⁴พบว่าเชื้อรา *Trichoderma harzianum* สายพันธุ์ S7113 ผลิตเอนไซม์แลคเคสในปริมาณมากในวันที่ห้าของการเพาะเลี้ยง อัตราการผลิตเอนไซม์แลคเคสสูงสุดในวันที่สิบสี่ จากนั้นจึงค่อยๆ ลดลง^³⁴แม้ว่าการหลั่งเอนไซม์จะเกิดขึ้นได้ในระหว่างระยะการเจริญเติบโตหลัก แต่โดยปกติแล้วจะถึงจุดสูงสุดในระยะกลางและถูกกระตุ้นโดยการบริโภคแหล่งคาร์บอนหรือไนโตรเจน^{^34,35}
แม้ว่าเอนไซม์แลคเคสจากเห็ด Pleurotus ostreatus NRC 620 จะแสดงกิจกรรมสูงในช่วงอุณหภูมิที่กว้างตั้งแต่ 50°C ถึง 80°C โดยมีกิจกรรมสูงสุด (69–98%) แต่พบว่ากิจกรรมสูงสุดอยู่ที่ 70°C (รูปที่ 2a) นอกช่วงอุณหภูมินี้ กิจกรรมของเอนไซม์ลดลงที่ประมาณ 70°C ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเอนไซม์ทำงานได้ดีที่อุณหภูมิสูง ซึ่งอาจเป็นเพราะอุณหภูมิสูงเพิ่มพลังงานจลน์ของปฏิกิริยา
ผลของอุณหภูมิปฏิกิริยา (a) และค่า pH (b) ต่อกิจกรรมของเอนไซม์แลคเคสในเห็ดหลินจือ *Pleurotus ostreatus* NRC 620 อุณหภูมิในช่วง 20 ถึง 90 °C ได้จากการบ่มส่วนผสมที่อุณหภูมิต่างๆ เป็นเวลา 5 นาทีก่อนเติมเอนไซม์และเริ่มปฏิกิริยา ผลของค่า pH ต่อกิจกรรมของเอนไซม์แลคเคสได้รับการประเมินโดยใช้ ABTS เป็นสารตั้งต้นในสารละลายที่มีบัฟเฟอร์ซิเตรต-ฟอสเฟต 0.1 M ในช่วงค่า pH 2.5 ถึง 7.0
ตามที่เอซิเกกล่าวไว้^อัล.33อุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดสำหรับเอนไซม์แลคเคส *Trametes polyzona* WRF03 คือ 55 °C ซึ่งเท่ากับอุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับ *Ganoderma lucidum*^{แลคเคส36}และคล้ายกับอุณหภูมิที่เหมาะสม (50 °C) สำหรับ *Trametes polyzona* KU-RNW02737^{แลคเคส} . ^{บัลเดรียน38}หมายเหตุว่า เช่นเดียวกับระบบเอนไซม์ย่อยสลายลิกนินอื่นๆ ช่วงอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดสำหรับแลคเคสคือระหว่าง 50 ถึง 70 องศาเซลเซียส
ผลการทดสอบแสดงให้เห็นว่าเอนไซม์มีกิจกรรมสูงสุดที่ pH 3.0 โดยมีกิจกรรมถึง 94% ที่ pH 3.5 อย่างไรก็ตาม เอนไซม์ยังคงมีกิจกรรมในช่วง pH กว้างตั้งแต่ 2.5 ถึง 7.0 (รูปที่ 2b) นอกจากนี้ เอนไซม์ยังมีกิจกรรมสูงกว่าในสภาวะที่เป็นกรดเมื่อเทียบกับสภาวะที่เป็นกลางหรือด่าง โดยมีกิจกรรมอย่างน้อย 77% ในช่วง pH ตั้งแต่ 2.5 ถึง 4.5 แต่ลดลงเหลือเพียงประมาณ 38% ที่ pH 7.0 ค่า pH ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับแลคเคสจาก *Trametes polyzona* WRF03 คือ 4.533 ซึ่งเท่ากับค่า pH ของแลคเคสจาก *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 และ *Trametes hirsuta* 41 อย่างไรก็ตาม ตามการศึกษาของ Chairin et al.^⁴²ค่า pH ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับเอนไซม์แลคเคสจาก *Polymorpha f. sp.* WR710-1 คือ 2.2 ในขณะที่ค่า pH ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับเอนไซม์แลคเคสจาก *Polymorpha f. sp.* IBL-04 คือ 5.043 การจับตัวของไอออนไฮดรอกไซด์ (สารยับยั้งแลคเคส) กับอะตอมทองแดงของแลคเคส T2/T3 อาจเป็นสาเหตุของการลดลงของกิจกรรมของแลคเคสภายใต้สภาวะ pH เป็นกลางหรือด่าง ซึ่งอาจขัดขวางการถ่ายโอนอิเล็กตรอนภายในจากศูนย์กลาง T1 ไปยังศูนย์กลาง T2/T3^{^{จำกัด}}กิจกรรมของเอนไซม์23,44
จากการบ่มเอนไซม์ที่อุณหภูมิต่างๆ พบว่าทั้งระยะเวลาการบ่มและอุณหภูมิมีผลต่อความเสถียรของเอนไซม์ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แลคเคสจาก *Trametes polyzona* NRC 620 แสดงความเสถียรสูงกว่าที่อุณหภูมิ 40℃ และ 50℃ โดยยังคงรักษาการทำงานเริ่มต้นไว้ได้ 68.33% และ 59.61% ตามลำดับ หลังจากผ่านไป 120 นาที (รูปที่ 3a) ในทางตรงกันข้าม ภายใต้สภาวะเดียวกัน (40℃ และ 50℃, 120 นาที) แลคเคสจาก *Trametes polyzona* WRF03 ยังคงรักษาการทำงานไว้ได้ 64.38% และ 42.92% ตามลำดับ^³³ในทางตรงกันข้าม การเพิ่มระยะเวลาและอุณหภูมิในการบ่มทำให้ความเสถียรของเอนไซม์แลคเคสจาก *Trametes polyzona* NRC 620 ลดลง หลังจากบ่มที่อุณหภูมิ 60℃ และ 70℃ เป็นเวลา 60 นาที กิจกรรมของเอนไซม์ลดลงเหลือ 39.24% และ 1.72% ตามลำดับ (รูปที่ 3a) สอดคล้องกับผลการทดลอง เอนไซม์แลคเคสจาก *Trametes polyzona* WRF03 แสดงความเสถียรที่สูงกว่าที่อุณหภูมิ 40 และ 50℃ ตลอดกระบวนการบำบัดด้วยความร้อน^³³ในทำนองเดียวกัน Lueangjaroenkit et^อัล.37และประธานและ^อัล.42รายงานการศึกษาความเสถียรของเอนไซม์แลคเคสจาก Trametes polyzona KURNW027 และ Trametes polyzona WR710-1 ที่อุณหภูมิ 50 °C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามลำดับ เนื่องจากแลคเคสเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพที่มีประโยชน์และสามารถนำไปใช้ในสาขาเทคโนโลยีชีวภาพต่างๆ ได้ จึงควรมีความเสถียรและประสิทธิภาพที่ดีในช่วงอุณหภูมิที่กว้าง
ความเสถียรต่ออุณหภูมิ (a) และความเสถียรต่อค่า pH (b) ของเอนไซม์แลคเคสจาก *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ความเสถียรต่ออุณหภูมิประเมินโดยการบ่มสารละลายเอนไซม์ในบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต 0.05 M (pH 7.0) ที่อุณหภูมิ 40, 50, 60 และ 70 °C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ตามลำดับ ความเสถียรต่อค่า pH ประเมินโดยการบ่มสารละลายเอนไซม์ในบัฟเฟอร์ซิเตรต 0.1 M และบัฟเฟอร์ Tris (pH 3, 4, 6 และ 7) ที่อุณหภูมิ 40 °C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง คำนวณกิจกรรมที่เหลืออยู่โดยใช้ ABTS เป็นสารตั้งต้นหลังจากการบ่ม
เพื่อกำหนดสภาวะที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการใช้งานและการเก็บรักษาเอนไซม์ เราได้ตรวจสอบผลของค่า pH ต่อความเสถียรของแลคเคส การสัมผัสกับค่า pH ที่แตกต่างกันส่งผลกระทบอย่างมากต่อความเสถียรของโครงสร้างโปรตีน ซึ่งส่งผลต่อความเสถียรและกิจกรรมของโมเลกุลเอนไซม์ ผลการวิจัยแสดงให้เห็นว่าเอนไซม์มีความเสถียรน้อยลงในสภาวะที่เป็นกรด ในขณะที่แสดงความเสถียรที่ดีขึ้นในค่า pH ที่สูงกว่า (บริเวณที่เป็นกลางและด่าง) ที่ค่า pH 7.0, 6.0, 4.0 และ 3.0 อัตราการคงอยู่ของเอนไซม์หลังจาก 120 นาทีอยู่ที่ประมาณ 100%, 62.54%, 52.39% และ 11.14% ตามลำดับ (รูปที่ 3b) แลคเคสจาก *Strombus multisus* WRF03 แสดงความเสถียรสูงกว่าในค่า pH ที่เป็นกลาง (5.5–6.5) และมีความเสถียรต่ำกว่าในค่า pH ที่เป็นกรด (ต่ำกว่า 4.0) หลังจากผ่านไป 120 นาที ที่ค่า pH 5.5, 6.0 และ 6.5 อัตราการคงอยู่ของเอนไซม์อยู่ที่ประมาณ 82%, 100% และ 93% ตามลำดับ^³³ไครินและคณะ^⁴²ระบุว่าแลคเคสจาก Trametes polyzona WR710-1 มีความเสถียรในช่วง pH 6.0 ถึง 7.0 ในขณะที่ Sayed et al.^⁴⁵ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าแลคเคสมีความเสถียรมากกว่าภายใต้สภาวะ pH เป็นกลาง อย่างไรก็ตาม แลคเคสจาก Cerrena unicolor ก็มีความเสถียรภายใต้สภาวะด่าง (pH 9.0) เช่นกัน^⁴⁶เอนไซม์แลคเคสที่ศึกษาแสดงให้เห็นถึงความเสถียรสูงในช่วงค่า pH ที่กว้าง ซึ่งอาจเป็นคุณลักษณะสำคัญสำหรับการใช้งานในอุตสาหกรรม
เนื่องจากไอออนโลหะบางชนิดมีทั้งผลกระตุ้นและยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ ดังนั้นจึงต้องพิจารณาผลกระทบของไอออนโลหะต่อการทำงานของเอนไซม์ในงานอุตสาหกรรม เรื่องนี้มีความสำคัญอย่างยิ่ง เพราะไอออนโลหะเป็นสารปนเปื้อนในสิ่งแวดล้อมทั่วไปที่สามารถส่งผลกระทบต่อความเสถียรและการสังเคราะห์เอนไซม์นอกเซลล์ได้^⁴⁷เพื่อตรวจสอบผลกระทบของไอออนโลหะหลายชนิดต่อเอนไซม์แลคเคสจากเห็ดหลินจือ (Pleurotus ostreatus) สายพันธุ์ NRC 620 เราจึงทำการทดลองที่เกี่ยวข้อง ดังแสดงในรูปที่ 4 พบว่า การเพิ่มความเข้มข้นของไอออนโลหะจาก 2.5 มิลลิโมลาร์ เป็น 10 มิลลิโมลาร์ ส่งผลเสียต่อการทำงานของเอนไซม์ ขึ้นอยู่กับชนิดของโลหะที่ใช้ ตัวอย่างเช่น^{เอ็มจี²⁺} , ^{โคอิก⁺} , ^Zn²⁺, และ^Cu²⁺สามารถกระตุ้นและเปิดใช้งานกิจกรรมของเอนไซม์ได้ ในขณะที่^{โซเดียม⁺} , ^{แมงกานีส²⁺} , ^Ca²⁺, และ^K⁺อาจยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้ ที่ความเข้มข้น 10 mM ไอออน Cu²⁺ และ Mg²⁺ เป็นตัวกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์แลคเคสจากเห็ด Pleurotus ostreatus NRC 620 ที่มีประสิทธิภาพมากที่สุด โดยให้ระดับการกระตุ้นประมาณ 34% และ 20% ตามลำดับ อย่างไรก็ตาม ที่ความเข้มข้น 10 mM ไอออน Ca²⁺ เป็นตัวยับยั้งการทำงานของเอนไซม์แลคเคสที่มีประสิทธิภาพมากที่สุด โดยลดการทำงานของเอนไซม์ลงประมาณ 60%
ผลกระทบของไอออนโลหะต่อกิจกรรมของเอนไซม์แลคเคสจากเห็ด Pleurotus ostreatus NRC 620 นำเอนไซม์แลคเคสไปบ่มในบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต (0.05 M, pH 7.0) ที่มีไอออนโลหะความเข้มข้นต่างๆ กัน คือ 2.5 mM และ 10 mM เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นจึงเริ่มปฏิกิริยาโดยการเติมสารตั้งต้น (ABTS) แล้วจึงวัดกิจกรรมสัมพัทธ์
ผลการศึกษาของเราสอดคล้องกับผลการศึกษาของนักวิจัยท่านอื่นที่พบว่า Mg²⁺ และ Cu²⁺ ช่วยเพิ่มกิจกรรมของ *Trametes polyzona* WRF03³ Castaño et al.⁴⁸ พบว่าแลคเคสจาก *Xylaria* sp. ได้รับการกระตุ้นในระดับหนึ่งโดยไอออนทองแดง (Cu²⁺) นอกจากนี้ Foroutanfar et al.⁴⁹ และ Si et al.⁵⁰ ได้ทำการศึกษาที่คล้ายกันกับแลคเคสจาก *Paraconiothyrium variabile* และ *Trametes pubescens* ตามลำดับ ตำแหน่งจับทองแดงชนิดที่ 2 (T2) ของเอนไซม์นี้สามารถอิ่มตัวด้วย Cu²⁺ ที่ความเข้มข้นที่กำหนด ซึ่งอาจอธิบายถึงการกระตุ้นกิจกรรมของแลคเคสที่ความเข้มข้นของ Cu²⁺³⁹ ที่สูงขึ้น เนื่องจากแลคเคสของเชื้อราที่ทำให้เกิดการเน่าขาวเป็นออกซิเดสที่มีอะตอมทองแดงหลายอะตอม ผลกระทบของไอออนทองแดงต่อกิจกรรมของแลคเคสจึงมีความหลากหลาย ตั้งแต่กระตุ้น ยับยั้ง ไปจนถึงเป็นกลาง⁵¹ ในทางตรงกันข้าม Zhou et al.^[52]รายงานว่า^Cu²⁺ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์แลคเคสจากปลวกใต้ดินไต้หวัน (Odontotermes formosanus) อย่างไรก็ตาม เอนไซม์แลคเคสจาก Cerena sp. HYB07^[53]และ Clitocybe maxima^[54]ไม่ได้รับผลกระทบจากไอออนทองแดง
ความจำเพาะของสารตั้งต้นแสดงโดยพารามิเตอร์จลนศาสตร์ (Km และ Vmax) ยิ่งความสามารถในการจับกันระหว่างสารตั้งต้นกับเอนไซม์แข็งแกร่งมากเท่าใด ค่า Km ก็จะยิ่งต่ำลง และความจำเพาะของสารตั้งต้นก็จะยิ่งสูงขึ้นเท่านั้น^{^3,21,55}ค่าพารามิเตอร์จลนศาสตร์ (Km และ Vmax) ของเอนไซม์แลคเคสจากเห็ด Pleurotus ostreatus สายพันธุ์ NRC 620 ถูกกำหนดโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 6.0 โดยการสร้างกราฟ Lineweaver-Burk (รูปที่ 5) เมื่อใช้ ABTS เป็นสารตั้งต้น ผลลัพธ์ที่ได้คือ 1.99 mM และ 16217 μmol^{นาที⁻¹} ^{แอล⁻¹,}ตามลำดับ Elsayed และคณะ^²¹รายงานว่าค่า Km สำหรับการออกซิเดชันของ ABTS คือ 0.1 mM และ 0.064 mM ตามลำดับ ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสัมพันธ์สูงของไอโซเอนไซม์ Lac A และ Lac B กับ ABTS นอกจากนี้ ค่า Vmax คือ 0.182 μmol^{นาที⁻¹}และ 0.603 ไมโครโมล^{นาที⁻¹}ตามลำดับ ค่า Km ที่ได้นั้นต่ำกว่าค่าของ Trametes polyzona WRF03 (8.66 mM) นอกจากนี้ ค่า Vmax ของพวกมัน (1429 mmol min⁻¹) ก็ต่ำกว่าเช่นกัน^{ต่ำกว่า}เมื่อใช้ ABTS เป็นสารตั้งต้น33 ในทำนองเดียวกัน ค่า Km ของความเข้มข้นของแลคเคส Lentinus squarrosulus MR13 และ Trametes sp. AH28-2 คือ 0.0714 mM และ 0.025 mM ตามลำดับ และค่า Vmax คือ 0.0091 mM min−1 และ 0.67 mM min−1 mg−1 (เทียบกับ ABTS)^{ตามลำดับ56,57}
ได้ทำการศึกษาผลของความเข้มข้นของ ABTS ต่อกิจกรรมของเอนไซม์แลคเคสจากเห็ดหลินจือ (Pleurotus ostreatus) สายพันธุ์ NRC 620 โดยได้สร้างกราฟ Lineweaver-Burk ของค่าผกผันของความเร็วปฏิกิริยาเริ่มต้นเทียบกับความเข้มข้นของ ABTS วัดปฏิกิริยาออกซิเดชันของ ABTS กับเอนไซม์แลคเคสที่มีความเข้มข้นต่างกัน (0.025–3.0 mM) ที่ pH 4.5 เพื่อหาค่าพารามิเตอร์จลนศาสตร์ (Vmax และ Km) คำนวณค่าคงที่จลนศาสตร์ของ Michaelis-Menten โดยใช้กราฟ Lineweaver-Burk ของค่าผกผันของความเร็วปฏิกิริยาเทียบกับความเข้มข้นของสารตั้งต้น โดยใช้โปรแกรม GraphPad Prism 6.01 ในการคำนวณค่าคงที่จลนศาสตร์จากกราฟ Lineweaver-Burk
เอนไซม์ที่ใช้ในการทำให้ใสแบบดั้งเดิม เช่น เพคติเนส จะย่อยสลายสารเพคติน ลดความหนืดและความขุ่น เอนไซม์เหล่านี้สามารถย่อยสลายพอลิแซ็กคาไรด์เชิงโครงสร้างได้อย่างมีประสิทธิภาพ และมักใช้ร่วมกับเอนไซม์อื่นๆ เช่น เซลลูเลสและเฮมิเซลลูเลส เพื่อเพิ่มปริมาณและความใส อย่างไรก็ตาม เพคติเนสไม่ได้มุ่งเป้าไปที่สารประกอบฟีนอลโดยเฉพาะ ซึ่งเป็นสาเหตุหลักของความขุ่นและการเปลี่ยนสีเป็นสีน้ำตาลจากการออกซิเดชัน โดยเฉพาะในน้ำผลไม้ เช่น น้ำแอปเปิลและน้ำองุ่น^⁵⁸ในทางตรงกันข้าม เอนไซม์แลคเคสจะเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของสารประกอบฟีนอล ทำให้เกิดพอลิเมอไรเซชันกลายเป็นโมเลกุลขนาดใหญ่ที่ไม่ละลายน้ำ ซึ่งสามารถกำจัดออกได้โดยการตกตะกอนหรือการกรอง กลไกนี้ไม่เพียงแต่ช่วยให้น้ำผลไม้ใสขึ้น แต่ยังช่วยยืดอายุการเก็บรักษาน้ำผลไม้ด้วยการลดโอกาสการเกิดสีน้ำตาลจากการออกซิเดชันที่เกิดจากสารประกอบฟีนอล นอกจากนี้ กระบวนการทำให้ใสโดยใช้เอนไซม์แลคเคสสามารถทำได้ภายใต้สภาวะการแปรรูปที่ไม่รุนแรง (pH 3.5–5.5 อุณหภูมิ 25–40 °C) ทำให้เหมาะสำหรับน้ำผลไม้ที่ละเอียดอ่อนโดยไม่กระทบต่อคุณค่าทางโภชนาการหรือคุณสมบัติทางประสาทสัมผัส^⁵⁹จากการศึกษาพบว่า การใช้เอนไซม์เพคติเนสสามารถทำให้่น้ำผลไม้ใสได้ภายใน 1-2 ชั่วโมง ในขณะที่การใช้เอนไซม์แลคเคสโดยทั่วไปต้องใช้เวลานานกว่า (3-6 ชั่วโมง) เพื่อลดสารประกอบฟีนอลให้หมดไป อย่างไรก็ตาม กระบวนการนี้สามารถปรับให้เหมาะสมได้โดยการตรึงเอนไซม์ หรือโดยการใช้เอนไซม์แลคเคสร่วมกับวิธีการทำให้ใสด้วยวิธีทางกล^⁶⁰จากการศึกษาครั้งนี้ การวิเคราะห์เอนไซม์ในสารสกัดดิบพบว่ามีกิจกรรมของเอนไซม์แลคเคสและอัลฟาอะไมเลสสูง ในขณะที่กิจกรรมของเอนไซม์เพคติเนสและไซลาเนสต่ำมาก และไม่พบกิจกรรมของเอนไซม์เซลลูเลส ดังนั้น การลดลงของความขุ่นและปริมาณสารฟีนอลจึงเกิดจากการทำงานของเอนไซม์แลคเคสเป็นหลัก ในขณะที่การเปลี่ยนแปลงความหนืดอาจเกิดจากการทำงานของเอนไซม์อะไมเลสบางส่วน
ตารางที่ 1 แสดงพารามิเตอร์ทางกายภาพและเคมีของน้ำแอปเปิลคั้นสดและตัวอย่างที่ผ่านการบำบัดด้วยแลคเคส ผลการวิจัยพบว่าปริมาณน้ำแอปเปิลคั้นสด (71.59%) ต่ำกว่าตัวอย่างที่ผ่านการบำบัดด้วยแลคเคส (87.34%) ซึ่งผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับผลการวิจัยของ Pilnik และ Orange⁶¹ซึ่งระบุว่าการใช้เอนไซม์ในกระบวนการแปรรูปผลไม้สามารถเพิ่มปริมาณน้ำผลไม้ ปรับปรุงการกรอง และได้น้ำผลไม้คุณภาพสูงใสสำหรับนำไปทำให้เข้มข้น การเพิ่มปริมาณน้ำผลไม้ส่วนใหญ่เกิดจากการเพิ่มปริมาณน้ำตาลที่ละลายได้ในน้ำผลไม้ ในระหว่างการไฮโดรไลซิสของผลไม้ด้วยเอนไซม์ เมโซเกลียและเพคตินในผนังเซลล์ของผลิตภัณฑ์จะถูกทำลายและเปลี่ยนเป็นสารที่ละลายได้ เช่น น้ำตาลที่เป็นกลางและกรด^62.ค่า pH ของน้ำแอปเปิลที่ผ่านการบำบัดด้วยเอนไซม์ต่ำกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) และค่า pH ของทั้งสองกลุ่มเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการเก็บรักษา (ตารางที่ 1) ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับผลการศึกษาของ Mark et al.⁶³ซึ่งสังเกตว่าค่า pH ของน้ำผลไม้เม็ดมะม่วงหิมพานต์ลดลงหลังจากเก็บรักษาหลังจากการให้ความร้อน การสลายตัวของเพคตินและการก่อตัวของกรดกาแลคทูโรนิกหลังจากการบำบัดด้วยเอนไซม์อาจเป็นสาเหตุของการเพิ่มขึ้นของค่า pH ในระหว่างการเก็บรักษา ค่า pH ของตัวอย่างที่ผ่านการบำบัดด้วยเอนไซม์คงอยู่ระหว่าง 4.05 ถึง 4.31 ตลอดการเก็บรักษา ในขณะที่ค่า pH ของน้ำแอปเปิลที่ไม่ผ่านการบำบัดอยู่ในช่วงระหว่าง 4.12 ถึง 4.33
ปริมาณกรดทั้งหมด (TA) ของทั้งตัวอย่างที่ไม่ผ่านการบำบัดและตัวอย่างที่ผ่านการบำบัดด้วยเอนไซม์แลคเคสมีแนวโน้มลดลงเมื่อระยะเวลาการเก็บรักษาเพิ่มขึ้น (ตารางที่ 1) การลดลงของปริมาณกรดนั้นเกิดจากการเปลี่ยนกรดอินทรีย์เป็นคาร์โบไฮเดรตหรือปฏิกิริยาทางเอนไซม์ รวมถึงการออกซิเดชันในระหว่างการเก็บรักษาน้ำผลไม้^⁶⁴ปริมาณความเป็นกรดโดยรวมของน้ำแอปเปิลควบคุมและตัวอย่างที่ผ่านการบำบัดด้วยเอนไซม์นั้นต่ำกว่าน้ำผลไม้ชนิดอื่น ๆ (น้ำสตรอว์เบอร์รี 0.9%, น้ำพลัม 2.2%, น้ำส้มคัมควอท 1.0%, น้ำแอปริคอต 2.4%, น้ำส้ม 0.8%) แต่ใกล้เคียงกับน้ำผลไม้ชนิดอื่น ๆ (เช่น น้ำลูกแพร์ 0.3%)^⁶²ความแตกต่างเหล่านี้ในน้ำแอปเปิลคั้นสดที่ไม่ผ่านการแปรรูป อาจเกิดจากปัจจัยหลายประการ เช่น สภาพการปลูก ปัจจัยทางพันธุกรรม ระดับความสุก และวิธีการแปรรูป^⁶⁵การลดลงของความเป็นกรดโดยรวมของน้ำแอปเปิลกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่ได้รับการบำบัดด้วยแลคเคส สอดคล้องกับผลลัพธ์ที่นำเสนอโดย Singh et al.^⁶⁶เกี่ยวกับการลดลงของความเป็นกรดโดยรวมของน้ำแอปเปิลจินหนูหลังจากเก็บรักษาไว้ 74 วัน ในทางกลับกัน Oshmiansky และ Wojdylo⁶⁷จากการศึกษาผลกระทบของวิธีการกรองแบบดั้งเดิม ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญใดๆ ในความเป็นกรดของน้ำแอปเปิล
ผลลัพธ์ที่แสดงในตารางที่ 1 บ่งชี้ว่าค่าปริมาณของแข็งที่ละลายได้ทั้งหมด (TSS) ของน้ำแอปเปิลที่ผ่านการบำบัดด้วยเอนไซม์แลคเคสสูงกว่าตัวอย่างที่ไม่ผ่านการบำบัด ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการศึกษาที่ตีพิมพ์ไว้ก่อนหน้านี้⁶⁸นอกจากนี้ ตารางที่ 1 แสดงให้เห็นว่าค่า TSS ของกลุ่มน้ำแอปเปิลควบคุมอยู่ที่ 9.58 ในช่วงเวลาเริ่มต้น และเพิ่มขึ้นเป็น 11.05 เมื่อสิ้นสุดระยะเวลาการเก็บรักษา ค่าเหล่านี้ต่ำกว่าค่า TSS ของน้ำแอปเปิลสดที่รายงานโดย Hamid et al.⁶⁹(11.2 และ 11.80 ตามลำดับ) ค่า TSS ของตัวอย่างน้ำแอปเปิลที่ผ่านการบำบัดด้วยแลคเคสเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ โดยเริ่มจาก 11.23 และเพิ่มขึ้นเป็น 12.93 หลังจากเก็บรักษาไว้ 2 สัปดาห์ที่อุณหภูมิ 4°C (ตารางที่ 1) การเพิ่มขึ้นของ TSS ที่คล้ายกันระหว่างการเก็บรักษายังพบในผลไม้ตระกูลส้ม มะนาว และส้มหวานด้วย การเพิ่มขึ้นของปริมาณของแข็งที่ละลายได้ทั้งหมด (TSS) ระหว่างการเก็บรักษาอาจเกิดจากการไฮโดรไลซิสของพอลิแซ็กคาไรด์ (แป้ง) ไปเป็นโมโนแซ็กคาไรด์ (น้ำตาล) การเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นเนื่องจากการสูญเสียน้ำของน้ำผลไม้ และการย่อยสลายของเพคตินในน้ำผลไม้ไปเป็นของแข็งที่ละลายได้ การเพิ่มขึ้นของปริมาณของแข็งที่ละลายได้ทั้งหมด (TSS) น่าจะเกิดจากการเพิ่มขึ้นของน้ำตาลที่ละลายได้ ซึ่งอาจเกิดขึ้นจากการเปลี่ยนเพคตินหรือเซลลูโลสไปเป็นน้ำตาลที่ละลายได้โดยเพคตินหรือเซลลูเลสตามลำดับ หรือโดยการไฮโดรไลซิสของแป้งไปเป็นน้ำตาล ดังที่ Hamed และคณะได้รายงานไว้^69.ผลของเอนไซม์แลคเคสต่อคุณสมบัติของน้ำแอปเปิลสามารถสังเกตได้ด้วยตาเปล่า เนื่องจากน้ำแอปเปิลที่ผ่านการบำบัดด้วยเอนไซม์แลคเคสจะมีลักษณะการไหลที่ดีกว่าและมีความหนืดต่ำกว่าน้ำแอปเปิลที่ไม่ผ่านการบำบัด การสังเกตนี้บันทึกไว้ในตารางที่ 1 โดยความหนืดของตัวอย่างที่ผ่านการบำบัดด้วยเอนไซม์อยู่ที่ 1.87 cP ในขณะที่ความหนืดของตัวอย่างควบคุมอยู่ที่ 2.95 cP การลดลงอย่างมีนัยสำคัญของความหนืดนี้อาจเกิดจากความสามารถในการกักเก็บน้ำที่สูงขึ้นของสารคล้ายเพคตินและการก่อตัวของโครงสร้างเครือข่ายที่เหนียวแน่น
ในการศึกษาครั้งนี้ ได้ทำการตรวจสอบผลของเอนไซม์แลคเคสต่อดัชนีการเปลี่ยนสี (BI) ของน้ำแอปเปิล โดยวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 420 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ ผลลัพธ์แสดงในตารางที่ 1 ในระหว่างการเก็บรักษา ค่า BI ของตัวอย่างน้ำแอปเปิลทั้งในกลุ่มที่ได้รับการบำบัดและกลุ่มที่ไม่ได้รับการบำบัดมีแนวโน้มเพิ่มขึ้นอย่างค่อยเป็นค่อยไป ค่า BI สะท้อนถึงระดับการเปลี่ยนสีและสามารถใช้เป็นตัวบ่งชี้ได้^{สำคัญ}ตัวบ่งชี้ปฏิกิริยาการเกิดสีน้ำตาลจากเอนไซม์และไม่ใช้เอนไซม์ ค่าการดูดกลืนแสงเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการเก็บรักษา (P < 0.05) เมื่อสิ้นสุดการเก็บรักษา_เอ420คุณค่าของตัวอย่างน้ำแอปเปิลในกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่ได้รับการบำบัดด้วยเอนไซม์เพิ่มขึ้นประมาณ 217% และ 121% ตามลำดับ (ตารางที่ 1) ผลลัพธ์บ่งชี้ว่าการบำบัดด้วยเอนไซม์สามารถลดระดับการเกิดสีน้ำตาลได้อย่างมีประสิทธิภาพประมาณ 56% ผลลัพธ์ของ Bezerra et al.^[19] สอดคล้องกับผลลัพธ์ของเรา พวกเขาใช้แลคเคส-กลูตารัลดีไฮด์-ใยมะพร้าวในการทำให้่น้ำแอปเปิลใสขึ้น ลดสีเดิมลงได้ 61%
แม้ว่าสารโพลีฟีนอลในน้ำผลไม้จะมีประโยชน์ต่อโภชนาการและการรักษาโรคในร่างกายมนุษย์ แต่ก็สามารถทำปฏิกิริยากับโปรตีน ทำให้เกิดความขุ่น ตะกอน หรือความไม่ใสของน้ำผลไม้ ส่งผลให้รสชาติและกลิ่นของผลิตภัณฑ์เปลี่ยนไป และลดอายุการเก็บรักษาลงได้^⁷¹งานวิจัยนี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อลดปริมาณสารประกอบฟีนอลในน้ำแอปเปิลอย่างปลอดภัยโดยใช้เอนไซม์แลคเคสจากเห็ด Pleurotus ostreatus NRC 620 ผลลัพธ์ที่แสดงในตารางที่ 1 แสดงให้เห็นว่าปริมาณสารประกอบฟีนอลทั้งหมดในน้ำแอปเปิลที่ผ่านการบำบัดด้วยเอนไซม์แลคเคสลดลงอย่างมีนัยสำคัญก่อนการเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 °C นอกจากนี้ ปริมาณสารประกอบฟีนอลทั้งหมดก็ลดลงระหว่างการเก็บรักษาในตัวอย่างทั้งสองที่ศึกษา (ตารางที่ 1) งานวิจัยโดย Sandri et al.^⁷²งานวิจัยแสดงให้เห็นว่าน้ำแอปเปิลที่ผ่านการบำบัดด้วยเอนไซม์สามารถคงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและปริมาณสารประกอบฟีนอลไว้ได้ อย่างไรก็ตาม ผลการศึกษาของ Lettera et al.^⁷³แสดงให้เห็นว่าการบำบัดน้ำส้มด้วยเอนไซม์แลคเคสจากเชื้อราสามารถลดปริมาณสารประกอบฟีนอลในน้ำส้มได้มากถึง 45%
สารประกอบฟีนอลได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีคุณสมบัติ เช่น การกำจัดอนุมูลอิสระ การลดและการดับออกซิเจนเชิงเดี่ยว การถ่ายโอนอะตอมไฮโดรเจน และการให้อิเล็กตรอนแก่อนุมูลอิสระ ทำให้พวกมันเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีประสิทธิภาพสูง^⁷⁴ดังนั้น ในการศึกษาครั้งนี้ จึงใช้วิธี DPPH และ FRAP ในการประเมินผลของเอนไซม์แลคเคสต่อฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของน้ำแอปเปิลที่เก็บไว้ในตู้เย็นเป็นเวลา 14 วัน (ตารางที่ 2) ทั้งสองวิธีแสดงให้เห็นว่าฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเพิ่มขึ้นระหว่างการเก็บรักษา ซึ่งอาจเกิดจากการเพิ่มขึ้นของสารประกอบฟีนอลอิสระหรือการเกิดผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาเมล์ลาร์ด (MRPs) โดยผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาเมล์ลาร์ดน่าจะเป็นสาเหตุของการเพิ่มขึ้นของฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ^⁷⁵ปฏิกิริยาการเกิดสีน้ำตาลที่ไม่เกี่ยวข้องกับเอนไซม์ (รวมถึงการสลายตัวของวิตามินซี ปฏิกิริยาเมล์ลาร์ด และการสลายตัวของน้ำตาลโดยใช้กรดเป็นตัวเร่งปฏิกิริยา) ทำให้เกิดเม็ดสีน้ำตาล (เมลานอยดิน) ผลิตภัณฑ์ขั้นกลางจากการสลายตัวของวิตามินซีและผลิตภัณฑ์จากการสลายตัวของน้ำตาล (เช่น สารประกอบคาร์บอนิล) สามารถทำปฏิกิริยากับกรดอะมิโนผ่านปฏิกิริยาเมล์ลาร์ดได้^⁷⁶แม้ว่าปรากฏการณ์ผิวสีน้ำตาลของผักและผลไม้ระหว่างการเก็บรักษาจะได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางแล้ว แต่ความเข้าใจของเราเกี่ยวกับปฏิกิริยาเหล่านี้ยังคงมีจำกัด^⁷⁷เมื่อเปรียบเทียบกับวิธี FRAP น้ำแอปเปิลที่ผ่านการบำบัดด้วยแลคเคสแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อวัดด้วยวิธี DPPH (ตารางที่ 2) และฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของตัวอย่างทั้งหมดเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อระยะเวลาการเก็บรักษาเพิ่มขึ้น ในการศึกษาครั้งนี้ใช้วิธีการวัดฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสองวิธีที่แตกต่างกัน เนื่องจากหลักการของทั้งสองวิธีแตกต่างกัน วิธี DPPH วัดความสามารถในการทำให้สารอนุมูลอิสระเป็นกลาง ในขณะที่วิธี FRAP วัดความสามารถในการลดไอออนเหล็ก ดังนั้นจึงแนะนำให้ใช้วิธีการหลายวิธีในการวัดฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ เพื่อให้เข้าใจฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของตัวอย่างที่ศึกษาได้ดียิ่งขึ้น^⁷⁸
หนึ่งในข้อค้นพบที่สำคัญของการศึกษาครั้งนี้คือ เอนไซม์แลคเคสจากเห็ด *Pleurotus ostreatus* สายพันธุ์ NRC 620 แสดงประสิทธิภาพสูงสุดที่อุณหภูมิ 70°C และ pH 3.0 เมื่อเปรียบเทียบกับเอนไซม์แลคเคสจากเชื้อราชนิดอื่นที่นิยมใช้ในการทำให้ใสของน้ำผลไม้ เช่น เอนไซม์แลคเคสจากเห็ด *Trametes versicolor* และ *Ganoderma lucidum* เอนไซม์ *P. ostreatus* NRC 620 มีความเสถียรต่อความร้อนสูงกว่าและมีค่า pH ที่เป็นกรดมากกว่า โดยทั่วไปแล้ว เอนไซม์แลคเคสจากเห็ด *Trametes versicolor* และ *Ganoderma lucidum* จะแสดงประสิทธิภาพสูงสุดในช่วงอุณหภูมิ 50-60°C และค่า pH ระหว่าง 3.5 ถึง 5.0 ความแตกต่างนี้อาจส่งผลให้ประสิทธิภาพในการทำให้ใสของน้ำผลไม้ดีขึ้น โดยเฉพาะน้ำผลไม้ที่เป็นกรดซึ่งความเสถียรที่ค่า pH ต่ำมีความสำคัญ คุณลักษณะเฉพาะของ *P. ostreatus* คือ... เมื่อเปรียบเทียบกับเอนไซม์แลคเคสจากเชื้อราชนิดอื่นๆ ที่เคยศึกษามา *Pleurotus ostreatus* NRC 620 แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพภายใต้สภาวะที่ท้าทายมากขึ้น อุณหภูมิที่เหมาะสมในการทำงานที่สูงขึ้นบ่งชี้ถึงข้อได้เปรียบที่อาจเกิดขึ้นในการใช้งานทางอุตสาหกรรม เช่น อัตราการเกิดปฏิกิริยาที่เร็วขึ้นและการลดการปนเปื้อนของจุลินทรีย์ ค่า pH ต่ำซึ่งเหมาะสมกับสภาพความเป็นกรดของน้ำผลไม้หลายชนิด อาจมีประโยชน์ในกระบวนการทำให้น้ำผลไม้ใส ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อการประยุกต์ใช้ในวงกว้าง ทำให้ *Pleurotus ostreatus* NRC 620 เป็นทางเลือกที่ใช้ได้จริงแทนแหล่งเอนไซม์แลคเคสจากเชื้อราแบบดั้งเดิม เมื่อเปรียบเทียบกับการศึกษาครั้งก่อนๆ เราพบว่าอุณหภูมิที่เหมาะสมคือ 60°C และค่า pH ที่เหมาะสมคือ 3.0 หลังจากปฏิกิริยาที่ 60°C เป็นเวลา 80 นาที เอนไซม์แลคเคสจาก *Ganoderma lucidum* ยังคงอยู่⁴⁶ร้อยละของกิจกรรม 79 ตามที่ Kurniawati และ Nicelle กล่าวไว้⁸⁰เอนไซม์จากเห็ดหลินจือ (Ganoderma lucidum) มีความเสถียรดีถึงปานกลางที่อุณหภูมิ 25°C และค่า pH ตั้งแต่ 5.0 ถึง 8.0 และมีความเสถียรที่ pH 6.0 และอุณหภูมิตั้งแต่ 10 ถึง 30°C ในการศึกษาครั้งนี้ เราพบว่าค่า pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดสำหรับกิจกรรมของเอนไซม์จากเห็ดหูหนู (Pleurotus ostreatus) คือ 3.0 และ 70°C ตามลำดับ หลังจากบ่มที่อุณหภูมิ 40°C และ 50°C เป็นเวลาสองชั่วโมง เอนไซม์ยังคงรักษาประสิทธิภาพไว้ได้ 68.33% และ 59.61% ตามลำดับ นอกจากนี้ เอนไซม์แลคเคสจากเห็ดหูหนูสายพันธุ์ NRC 620 ยังแสดงกิจกรรมสูงในช่วงอุณหภูมิที่กว้างตั้งแต่ 50°C ถึง 80°C เกือบถึงระดับกิจกรรมสูงสุด (69%–98%) โดยพบกิจกรรมสูงสุดที่อุณหภูมิ 70°C
โดยสรุปแล้ว เอนไซม์แลคเคสจากเห็ดนางฟ้า NRC620 ที่ได้ภายใต้สภาวะคงที่ แสดงให้เห็นถึงกิจกรรมและความเสถียรที่ดีที่สุดในช่วงค่า pH และอุณหภูมิที่หลากหลาย แสดงให้เห็นถึงความเสถียรที่เหนือกว่าเมื่อเทียบกับแหล่งเอนไซม์อื่นๆ การเติม MgSO₄ และ CuSO₄ ในปริมาณ 10 mM ช่วยเพิ่มกิจกรรมของเอนไซม์ได้ประมาณ 21% และ 35% ตามลำดับ เมื่อนำไปแปรรูปเป็นน้ำแอปเปิล เอนไซม์ช่วยลดค่า pH และความหนืด ในขณะที่ปริมาณสารฟีนอลลดลงเพียงเล็กน้อยระหว่างการเก็บรักษา
ผลการวิจัยยืนยันถึงศักยภาพของเอนไซม์แลคเคสในอุตสาหกรรมอาหาร โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการทำให้เครื่องดื่มใส ด้วยการย่อยสลายสารประกอบฟีนอลโดยเฉพาะ เอนไซม์แลคเคสไม่เพียงแต่ลดความขุ่นและเพิ่มความใสเท่านั้น แต่ยังคงรักษาคุณภาพของน้ำผลไม้ภายใต้สภาวะการทำงานที่ไม่รุนแรงอีกด้วย แตกต่างจากสารทำให้ใสแบบดั้งเดิม เช่น เจลาติน เบนโทไนต์ และซิลิกาเจล เอนไซม์แลคเคสไม่ก่อให้เกิดของเสียหรือทำลายกลิ่นหอมของเครื่องดื่ม ทำให้เป็นทางเลือกที่เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมและยั่งยืนกว่า ยิ่งไปกว่านั้น เมื่อเปรียบเทียบกับเอนไซม์และวิธีการกรองอื่นๆ เอนไซม์แลคเคสยังให้ผลลัพธ์ที่ตรงเป้าหมายและคุ้มค่าโดยไม่ลดทอนคุณภาพของผลิตภัณฑ์
Kyomuhimbo, HD และ Brink, HG. การประยุกต์ใช้และกลยุทธ์การตรึงเอนไซม์แลคเคสที่มีทองแดงเป็นองค์ประกอบ; บทวิจารณ์. Heliyon 9, e13156 (2023).

วันที่เผยแพร่: 15 ธันวาคม 2025